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miRNA cDNA第--鏈合成試劑盒說明書
點擊次數(shù):1535 更新時間:2020-02-24
miRNA cDNA第--鏈合成試劑盒說明書
 
  
miRNA cDNA Kit
miRNA cDNA第--鏈合成試劑盒
目錄號:K2141
保存條件:-20℃保存。
組分說明
 
             Cat. No.                              K2141
             Kit Size                               25  次
             1mM Tris,PH8.0                          1 ml
             E. coli    Poly(A) Polymerase(5U/μl)   15 μl
             10×Poly(A) Polymerase Buffer           80 μl
             10mM ATP                               15 μl
             25μM RT primer                         90 μl
             5×RT Buffer                            120 μl
             超純dNTPs(10mM each)                     30 μl
             SuperRT Reverse Transcriptase          15 μl
             RNase-Free Water                        1 ml
 
             本產(chǎn)品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途  
 
 產(chǎn)品簡介
 
  本試劑盒采用在miRNA  3’末端加多聚A尾的方法來使miRNA具有Poly(A)尾,之后再使用Oligo(dT)-Universal  tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),終合成miRNA對應(yīng)
的第--鏈cDNA。
  miRNA cDNA第--鏈合成試劑盒包含miRNA  3’末端Poly(A)尾修飾過程及修飾后逆
轉(zhuǎn)錄過程需要的全部試劑。該試劑盒具有非常高的 Poly(A)修飾和逆轉(zhuǎn)錄效率,可以從
1 ng-2 μg的total  RNA中有效獲得miRNA對應(yīng)的cDNA第--鏈。并且操作簡便、快捷,
可以用于從一個反應(yīng)合成的cDNA中同時檢測多種miRNA,不僅減少了誤差、節(jié)約了樣
品,同時還實現(xiàn)了檢測的高通量。
  
備注:本試劑盒須與miRNA熒光定量檢測試劑盒(K2142)配套使用。
  
自備實驗材料:1 ng-2 μg的總 RNA,或0.1 ng-1 μg的小分子RNA。
 
 注意事項
 
預(yù)防RNase污染,應(yīng)注意以下幾方面:
1.使用無RNase的塑料制品和槍頭,避免交叉污染。
2.玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時,塑料器皿可在0.5  M NaOH中浸泡
   10分鐘,用水*沖洗后高壓滅菌。
3.配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。
4.操作人員戴一次性口罩和手套,實驗過程中要勤換手套。
 
操作步驟
 A.miRNA加Poly(A)尾的過程:
1.首先根據(jù)所用RNA的量,按如下公式,用1 mM Tris(PH8.0)來稀釋10 mM ATP:
                        ATP稀釋系數(shù)=5000/__ng的總RNA
   例:如果總RNA的起始用量為100 ng,那么ATP稀釋系數(shù)=5000/100=50。即將ATP
   稀釋50倍(1 μl的10 mM ATP加49 μl的1 mM Tris,PH8.0)。
2.向冰浴中預(yù)冷的無RNase反應(yīng)管中加入以下試劑至總體積25 μl。
 
            試劑                                    體積          終濃度
            total RNA*                            X μl       可達2 μg
            10×Poly(A) Polymerase Buffer          2.5 μl        1×
            第“1”步中稀釋好的ATP                         1 μl          —
            E. coli    Poly(A) Polymerase(5U/μl)  0.5 μl       2.5 U
            RNase-Free Water                   up to 25 μl      —
                      *反應(yīng)中使用的total RNA必須含有小分子RNA。
   此過程也可以直接使用小分子RNA(建議加入量為2-5  μl。請根據(jù)目的miRNA的豐
   度來確定加入量)。
3.輕輕混勻上述反應(yīng)液,短暫離心將液體收集于管底。37℃,孵育15分鐘。此過程結(jié)
   束后,立刻進行第--鏈cDNA的合成,或于-20℃暫存。如需長期保存,建議存放于
   -80℃。
B.修飾后的miRNA cDNA第--鏈合成的過程:
1.向冰浴中預(yù)冷的無RNase反應(yīng)管中加入下表中試劑,至終體積20 μl:
 
                     試劑                               體積
                     上述Poly(A)反應(yīng)液                      4 μl
                     超純dNTPs(10mM each)                1 μl
                     25μM RT primer                    3 μl
                     5×RT Buffer                       4 μl
                     SuperRT Reverse Transcriptase    0.5 μl
                     RNase-Free Water                 7.5 μl
 
2.輕輕混勻上述反應(yīng)液,短暫離心將液體收集于管底。42℃,孵育50分鐘。
3.85℃,孵育5分鐘,終止反應(yīng)。合成的  cDNA反應(yīng)液可以直接進行熒光定量檢測實
   驗,也可以于-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>
     相關(guān)產(chǎn)品信息
                 目錄號             產(chǎn)品名稱
                K0627          miRNA提取試劑盒
                K2141          miRNA cDNA第--鏈合成試劑盒
                K2142          miRNA熒光定量  PCR檢測試劑盒
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